用途

PCR

说明

KOD -Plus- Neo在高保真性PCR酶KOD -Plus-系列技术的基础上，应用了本公司新开发的「延伸增强剂」，保持了KOD -Plus-系列高保真性（约为Taq的80倍）的同时，通过抑制<停滞现象>，明显提高了对微量模板DNA、长目的片段的扩增效率。

特征

●可对微量模板DNA进行高保真・高效率的扩增

通过应用延伸增强剂技术，即便是微量模板DNA也可对目的基因进行高保真・高效率的扩增。同时本酶具备高保真性（约为Taq的80倍），可准确地对低拷贝数模板的目的基因进行扩增。

※PCR错配率是通过使用各种酶以人基因组DNA为模板扩增β-globin基因(2.4kb)，对PCR产物进行TA克隆后，对96个克隆进行测序分析，测得的结果。

●缩短了延伸时间<30sec./kb>（长目的片段更方便）

延伸时间从原产品的60sec./kb缩短到30sec./kb。对长目的片段的扩增更加方便。

●实现了各种引物同一循环条件

20mer以上的引物(Tm值>63℃)可先尝试2步法。循环条件无需探讨非常简便。（请参考基本反应条件）
*Tm值采用最邻近法(Nearest Neighbor method)计算得到的值。

●长目的片段的扩增
提高了延伸性，可对各种长度的目的片段进行扩增。已通过实验确认可对24kb的基因组DNA进行扩增。

●采用热启动法，提高了PCR性能

原理

KOD DNA polymerase具有强有力的3’→5’核酸外切酶活性（校正活性），可准确地对目的片段进行扩增，作为克隆用PCR酶获得了广泛的好评。 然而，高保真性PCR酶在20〜30循环以后，容易出现扩增无法持续的<停滞现象>。

KOD -Plus- Neo在高保真性PCR酶：KOD -Plus-系列技术的基础上，应用了本公司新开发的「延伸增强剂」，保持了KOD -Plus-系列高保真性（约为Taq的80倍）的同时，通过抑制<停滞现象>，明显提高了对微量模板DNA、长目的片段的扩增效率。

实验例

1. Total RNA的各种基因全长ORF的扩增

以HeLa细胞来源的Total RNA逆转录后得到的cDNA（Total RNA 50 ng相当）为模板， 对各种蛋白激酶的ORF（open reading frame）的全长扩增。反应根据各PCR酶的推荐条件进行了30个循环。结果可见，只有用KOD -Plus- Neo的情况下，所有的基因都能得到明亮的扩增产物，所有的ORF都能迅速地进行克隆。

2. β-globin基因上各种长度区域的扩增效率・延伸性的比较

以人基因组DNA（50ng）为模板，对各种长度的β -globin 基因进行扩增。反应按各PCR 酶的推荐条件，进行了30个循环。结果显示，只有用KOD -Plus- Neo 的情况下，17.5 kb 的片段能确认得到明亮的条带。 而且，17.5 kb 以下的片段，用KOD -Plus- Neo 的得率要高得多。

产品内容

【KOD-401】
KOD -Plus- Neo (1U/μl)200μl ×1支
10×PCR Buffer for KOD -Plus- Neo [KOD-4B]1ml ×1支
25mM MgSO4[KOD-2S]1ml ×1支
2mM dNTP [NTP-201]1ml ×1支

※50μl反应体系的情况下可使用200次。

组分:
50mM   Tris-HCl (pH8.0)
25mM   KCI
0.1mM  EDTA
1mM     DTT
0.05%    Tween^®-20
0.05%    Nonidet^®P-40
50%       Glycerol

活性的定义:

在75℃活性测定条件下，在30分钟内摄入10nmoles的全核苷酸使成为酸不溶物时所需酶的活性定义为1U。

来源:

E.coli重组体

基本反应条件

灭菌蒸馏水X μl
2mM dNTPs5μl
25mM MgSO43μl
10pmol/μl Primer F1.5μl
10pmol/μl Primer R1.5μl
KOD -Plus- Neo (1.0U/μl)1μl
Genomic DNA～200ng
Plasmid DNA～50ng
cDNA～200ng（RNA相当）
10×PCR Buffer for KOD -Plus- Neo5μl

Total Volume50μl

〈2 Step Cycle〉^*
94℃    2min.
         ↓
98℃    10sec.
68℃    30sec./kb 25～45 cycles

〈3 Step Cycle〉^*
94℃    2min.
        ↓
98℃    10sec.
Tm℃    30sec.
68℃    30sec./kb 25～45 cycles

〈Step Down Cycle〉^*
94℃    2min.
        ↓
98℃    10sec.
74℃    30sec./kb 5 cycles
        ↓
98℃    10sec.
72℃    30sec./kb 5 cycles
        ↓
98℃    10sec.
70℃    30sec./kb 5 cycles
        ↓
98℃    10sec.
68℃    30sec./kb 15～30 cycles
        ↓
68℃    7min.

*引物的Tm值高于63℃的情况下，请用两步法。
引物的Tm值在63℃以下，或用两步法无法确认到扩增时，请尝试用三步法。
此外，当扩增产物出现杂带或弥散时，请尝试Step down方法。

※Tm值采用最邻近法（Nearest Neighbor method）计算得到的值。
引物的Tm值以及扩增产物的Tm值计算请点击此处进入在线工具