用途

PCR

说明

该产品是以改良型KOD DNA polymerase（UKOD）为基础开发的PCR用2× Master Mix，兼具保真性好和扩增效率高的特点。

使用改进的延伸增强剂技术，可以实现超高速PCR反应:长度在1kb以内的片段仅需1秒， 1~10kb时延伸速度为5秒/kb，10kb及以上延伸速度为10秒/kb。该酶具有很高的反应成功率，针对含肌苷(dI)或尿嘧啶(dU)的引物模板或者粗体样品都能很好地进行扩增。此外，因为预添加了抑制酶活性和3`5`外切酶活性的单抗，可以进行高特异性的热启动PCR。

特征

●高速PCR

●简便

除了引物和模板之外的PCR组分都包含在预混液中，简化了配液流程，同时也提高了实验的可重复性。此外，包含电泳指示剂的KOD One^TM PCR Master Mix –Blue-(Code No. KMM-201)可以在PCR反应完成后直接点样，无需另外添加Loading Dye。

●超高的保真性
保真性约为Taq DNA 聚合酶的80倍，保持了KOD系列产品中保真性最高的水准

●粗样品也可高效扩增（实验例2）

●可以使用含肌苷(dI)或尿嘧啶(dU)的引物和模板（实验例5）

实验例

1. 高速PCR实验

以人基因组DNA为模板，可进行超快速PCR扩增。结果显示，KOD One^TMPCR Master Mix及KOD One^TMPCR Master Mix -Blue-扩增1kb以下的目的片段时延伸时间设为1 sec.，1 ~10 kb的目的片段时按5 sec./ kb设定可以得到清晰的扩增条带。

2.粗样品扩增

使用KOD One^TMPCR Master Mix，比较从血液、鼠尾裂解液（碱裂解液）分别扩增人β-globin基因和小鼠Thy-1基因结果。反应根据各PCR酶推荐条件进行，延伸时间5 sec./ kb。

结果显示，只有KOD One^TMPCR Master Mix能够得到明确的条带。

3.逆转录反应液（cDNA）的添加量对扩增的影响

逆转录反应液中残留的RNA对PCR有抑制作用，过量添加cDNA模板会使扩增效果变差。KOD One^TMPCR Master Mix不易受RNA的抑制作用。为了确认可引入的cDNA的量，通过加入不同量的cDNA模板，检测扩增TFR基因的效果。与原来的产品及其他公司的产品相比，即使添加较多的cDNA也能得到良好的扩增。

产品内容

【KMM-101】
Master Mix                1mL ×5支
【KMM-201】
Master Mix（含染料）     1mL ×5支

基本反应条件

灭菌蒸馏水X μl
KOD One PCR Maaster Mix25μl
各引物15pmoles each
模板1～50ng(Plasmid)
10～200ng(Genome DNA)
～750ng[RNA相当](cDNA)
～5μl(粗样品)

Total Volume50μl

〈2步法循环〉*
98℃ 10sec.
68℃ 5~10sec./kb 25～45 cycles

〈3步法循环〉*
98℃ 10sec.
(Tm-5)℃ 5sec.
68℃ 1~10sec./kb 25～45 cycles

延伸时间请根据片段长度进行设定：
1～10 kb:5 sec./ kb
10 kb～:10 sec./ kb

〈Step down循环〉*
98℃, 10sec.
74℃, 1~10sec./kb 5 cycles
↓
98℃, 10sec.
72℃, 1~10sec./kb 5 cycles
↓
98℃, 10sec.
70℃, 1~10sec./kb 5 cycles
↓
98℃, 10sec.
68℃, 1~10sec./kb 15～25 cycles


*基本上以2步法循环进行。引物的Tm值低于68℃或用2步法循环未见扩增时，请试一下3步法循环。另外，扩增10kb以上的目的片段时，如果出现Long PCR片段或非特异条带及弥散，请试一下Step down循环。 ※Tm值采用最邻近法（Nearest Neighbor method）计算得到的值。
引物的Tm值以及扩增产物的Tm值计算请点击此处进入在线工具