用途

多重PCR

亚硫酸氢盐处理的DNA的扩增

说明

KOD -Multi & Epi-™是使用基因改良的KOD DNA polymerase (UKOD)而开发的高保真性PCR酶。
通过改良，含较多尿嘧啶的模板及含次黄嘌呤核苷的引物也可以使用了。而且，因添加了延伸加速剂等组分，延伸性提高了，针对不同序列及扩增长度，不易于引起扩增偏差。
因此，KOD -Multi & Epi-™可用于多重PCR及亚硫酸氢盐处理后的DNA的扩增（表观遗传学分析）、metagenome分析等各种各样的用途。另外，该酶保真性是Taq polymerase的11倍，得到的扩增产物可通过克隆，用于原来的测序分析及高通量测序等广泛用途。

特征

●均一地扩增（低偏差）
可以在1 kb以下的短片段至10 kb左右的长链目的片段这一广范围内进行高特异且均一性的多重PCR。将因GC偏差引起的对扩增的影响降到了最低程度、可均一地扩增基因组及转录组的各种区域的片段。

利用这一特性，可制备用于下一代测序分析的扩增产物。

●含有较多尿嘧啶DNA的扩增

可对亚硫酸氢盐处理后的含有较多尿嘧啶的DNA进行高效率地扩增。已确认最大可扩增约1.5 kb。

●可使用含有I或U的引物

以前的高保真性PCR酶，使用含有I或U的引物时扩增困难，KOD -Multi & Epi- 则可以使用这类引物进行分析。

●高保真性　

是Taq polymerase保真性的11倍（与KOD FX Neo相同），扩增产物可用于各种用途。

●可扩增粗样品

不易受粗样品的影响，比如使用血液样品，还可对动植物的裂解物进行基因分型，甚至对土壤、食品样品等进行扩增。

●高效率　

因为添加了延伸增强剂，提高了PCR效率，单重PCR最短延伸时间可以缩短到15 sec./ kb。

※粗样品、使用亚硫酸氢盐处理的DNA样品及进行长链多重PCR时，为了提高效率，延伸时间推荐设为30~60 sec./ kb。

实验例

1. 多重PCR性能比较

使用纯化的人基因组DNA及血液样品，对1kb以下及1~10kb的多数的目的片段，用各种PCR酶进行多重PCR性能的比较（50ul反应体系）。结果显示，只有使用KME时，才能在所有的条件下得到偏差性低的良好结果。KME不易受血液成分的抑制，可以得到与用纯化的基因组DNA扩增相同的偏差小的扩增结果。

2.使用NGS对长链（10kb）目的片段的多重扩增时偏好性的验证

用6种PCR试剂对10种10kb的目的片段（其中5种目的片段的GC含量在70%的区域含有300bp以上的长度）进行扩增，将确认能扩增的试剂的PCR产物纯化后用Covaris^®片段化，使用Truseq^®nano LT kit制备文库，使用Miseq^®(illumina)进行测序分析。以Read数最多的目的基因为基准（1.0），将各个Read数的比值作成图。

电泳结果显示，虽然泳道3，5中用A公司的试剂也得到了良好的扩增，但是NGS分析的结果中，产生了扩增偏好性。另一方面，KME在10种目的基因中，因为Read数的比值在0.6~1.0之间，可见均一性良好。

3.亚硫酸氢盐处理过的DNA的扩增效率的比较

没甲基化的C用亚硫酸氢盐处理后转变成U，通过PCR测序分析，就可以与甲基化的C区别开。通过这样处理，目的片段序列中的AT含量变高，另外因为被片段化后，通常亚硫酸氢盐处理过的DNA的扩增比较困难。

以亚硫酸氢盐处理过的Jurkat细胞来源的甲基化DNA（55ng）为模板，用各种DNA聚合酶扩增900~1500bp的片段进行比较。结果显示，大约1.5kb以内的目的片段，用KME都能得到一个良好的扩增结果。然后进一步对于1583bp的扩增产物，使用克隆试剂盒（Target Clone-Plus-）进行克隆之后，进行测序分析，可以确认亚硫酸氢盐处理过的目的片段也得到了扩增（数据没有在此出示）。

另外，对于TGF (917bp)，进行模板量的探讨。结果显示，可以检测到最低5ng的量。通过亚硫酸氢盐处理可以使DNA片段化，KME对于这样处理过的样品，也可以高灵敏度地检测到约1kb的目的片段。

4.含有次黄苷酸（I）的引物扩增效率的比较

根据E.coli的DNA聚合酶Ⅰ的氨基酸序列设计含次黄苷酸（I）的兼并引物，用KME和KOD-PLUS- Ver.2（原来的产品）进行扩增。

结果显示，通过使用KME，可使用用原来的KOD DNA聚合酶等高保真性PCR酶不能使用的含有I的兼并引物进行扩增。同样也可使用含U的引物进行扩增。

产品内容

KOD -Multi & Epi-(1U/μl)200μl×1支
2×PCR Buffer for KOD -Multi & Epi-1.7 ml×3支

※50μl反应体系的情况下可使用200次。

※2×PCR Buffer for KOD -Multi & Epi-中含有dNTPs(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)及Mg²⁺(终浓度2.0mM)。

注意事项

*酶溶液中虽然含有消防法危险物 第4类 易燃液体 第3石油类 属于水溶性液体的50%的甘油，但是已确认在着火点测试实验中不属于危险物。

基本反应条件

(1)单重PCR反应条件

灭菌蒸馏水Xμl
2×PCR buffer for KOD -Multi & Epi-
25μl
10pmol/μl Primer F1.5μl
10pmol/μl Primer R1.5μl
模板～200ng(Genomic DNA)
～50ng(Plasmid)
～200ng〔RNA相当〕(cDNA)
～5μl(粗样品)
KOD -Multi & Epi-(1.0U/μl)1μl

Total Volume50μl

〈2步法循环〉

[引物Tm值高于65℃时]

94℃, 2min.

↓

98℃, 10sec.

68℃, 15～60sec./kb 30 cycles

Cycle(2)

〈3步法循环〉

[引物的Tm值低于65℃时]

94℃, 2min.

↓

98℃, 10sec.

Tm℃, 10sec.

68℃, 15～60sec./kb 30 cycles

(2)多重PCR反应条件

灭菌蒸馏水Xμl
2×PCR buffer for KOD -Multi & Epi-
25μl
10pmol/μl Primer F1.5μl
10pmol/μl Primer R1.5μl
模板Genomic DNA ～200ng
Plasmid DNA ～50ng
cDNA ～200ng(RNA相当)
粗样品～5μl
KOD -Multi & Epi-(1.0U/μl)1μl

Total Volume50μl

〈2步法循环〉

[引物的Tm值高于65℃时]

94℃, 2min.

↓

98℃, 10sec.

68℃, 15～60sec./kb 25 cycles

Cycle(2)

〈3步法循环〉

[引物的Tm值低于65℃时]

94℃, 2min.

↓

98℃, 10sec.

Tm℃, 30sec.

68℃, 15～60sec./kb 25 cycles

(3)使用亚硫酸氢盐处理的DNA进行PCR的反应条件

反应液组成
灭菌蒸馏水Xμl
2×PCR buffer for KOD -Multi & Epi-
25μl
10pmol/μl Primer F1.5μl
10pmol/μl Primer R1.5μl
亚硫酸氢盐处理DNA ～200ng
KOD-Multi & Epi-(1.0U/μl)1μl

Total Volume50μl

Cycle

〈3步法循环〉

94℃, 2min.

↓

98℃, 10sec.

Tm℃, 30sec.

68℃, 15～30sec./kb 40 cycles

几点建议

※Tm值采用最邻近法（Nearest Neighbor method）计算得到的值。
引物的Tm值以及扩增产物的Tm值计算请点击此处进入在线工具