用途

Realtime RT-PCR

说明

Tth DNA polymerase是在Mn²⁺存在下，具有很强的逆转录活性的独特的酶，在单一反应体系内可进行cDNA的合成及PCR的连续反应。利用该特性，开发出单酶一步法定量PCR试剂盒，与在同一反应中使用RTase及Taq DNA polymerase的「两酶一步法」体系试剂相比，使用单酶时，最适反应条件的设定较容易，而且能够得到更高的分析效率。

特征

●一步法高通量分析
本品以RNA为模板，能够在同一反应体系内进行定量PCR分析，非常适合于需要快速分析的多重检测体系。

●特异性高
本品采用抗体法热启动，对控制非特异性扩增非常有效。

●适用性广
探针法及SYBR^®Green I 法都可以适用。

●可用于不同类型的仪器
因为含有参比染料（Passive reference），可适用于需要校正的检测仪器(如Applied Biosystems^®StepOnePlus^TM等)。

●可用于易于形成高级结构的RNA和高GC含量的模板
可用于使用玻璃毛细管型的检测仪器(如Roche Diagnostics公司的LightCycler^® )。
逆转录反应在高温下进行，所以也适用于易于形成高级结构的模板RNA。而且，众所周知，Tth DNA polymerase对GC含量高的序列的扩增效率非常高，可有效检测GC含量高的目的片段。

实验例

1.与『两步法体系(RTase + Taq)』相关性的比较

通过以各种人组织来源的RNA为样品，对蛋白酶δ（PKCδ）的表达进行分析，比较了与使用一般的两步法的荧光定量PCR分析法的相关性。
黄色柱状图表示的是使用本产品的定量结果，左边是使用50ng、右边是使用200ng的Total RNA得到的结果。蓝色柱状图表示的是使用本公司高效率逆转录试剂盒「ReverTra Ace -α-^®」[FSK-101]与Taq酶为基础的荧光定量PCR试剂「SYBR^®Green Realtime PCR Master Mix -Plus-」[QPK-212]组合的两步法体系检测的结果。

结果显示，使用一步法的本产品与两步法体系得到了相同的结果。

2. TaqMan^®探针法分析的性能比较

RNA-direct^TM与两酶一步法(仪器:使用BioFlux公司的Line Gene)
以mRNA为模板，与使用Taq+RTase混合型的A公司的试剂(两酶一步法体系)进行了比较实验。
以人培养细胞提取的mRNA（10ⁿ倍稀释系列(n=2)）为模板，用TaqMan^®探针法对β-actin的mRNA进行检测（作100倍稀释，使用20μl反应液中含有5ng的Poly(A)⁺RNA）。结果显示，使用RNA-direct^TMRealtime PCR Master Mix的反应中，即使使用A公司试剂推荐的反应条件，也会得到起峰早及直线性的良好结果。

3. SYBR^®Green分析法中直线性的讨论

RNA-direct^TM与两酶一步法（仪器:使用ABI公司的PRISM^®7900HT）
以HeLa细胞来源的Total RNA（10ⁿ倍稀释系列(n=2)）为模板,用SYBR^®Green分析法检测β-actin的mRNA（作100倍稀释，使用20μl反应液中含有75ng的Total RNA）。
结果显示，与Taq+RTase混合型的B公司试剂盒相比，RNA-direct^TMSYBR^®Green Realtime PCR Master Mix的反应中，至少可以在7个梯度的稀释系列中表示出高度相关性。

4. SYBR^®Green分析法中性能的比较

RNA-direct^TM与一酶一步法(仪器:使用Roche公司的LightCycler^TM)
以人培养细胞提取的Poly(A)+RNA（10ⁿ倍稀释系列(n=2)）为模板，用SYBR^®Green分析法检测G3PDH 的mRNA (作100倍稀释，使用20μl反应液中含有5ng的Poly(A)+ RNA)。
结果显示，与同样使用Tth DNA Polymerase的C公司试剂相比，RNA-direct^TMSYBR^®Green Realtime PCR Master Mix的检测中，起峰早、信号强以及检测灵敏度都得到了极大提高。

产品内容

〈QRT-101, QRT-201〉
Master Mix0.5ml ×5支
50mM Mn(OAc)₂0.5ml ×1支
(50μl反应体系可使用100次，20μl反应体系可使用250次)


保存 -20℃(避光保存)

基本反应条件

〈SYBR^® Green I 法〉
使用ABI PRISM^®7900HT(Applied Bio.)
灭菌水X μl
Master Mix25μl
50mM Mn(OAc)₂2.5μl
各Primer10pmoles each
RNA样品<1μg

Total Volume50μl

Cycle
90℃    30sec.
61℃    20min.
        ↓
95℃    60sec.
        ↓
95℃    15sec.
^*55～65℃    15sec. 45cycles
74℃    45sec.

※退火温度，请根据引物的Tm在55～65℃范围内进行调整。