用途

Realtime PCR用cDNA的合成

说明

ReverTra Ace^® qPCR RT Master Mix(Code No. FSQ-201)是利用本公司高性能逆转录酶『ReverTra Ace^®』开发的Realtime PCR用的逆转录试剂盒，是包含逆转录反应用的所有组分的5×浓度的完全预混型试剂，只需添加模板RNA和水即可迅速地开始反应。另外，由于采用了最适用于Realtime PCR用短链目的片段cDNA合成的反应组分，可在短时间内高效率地制备适用于Realtime PCR的cDNA模板。 

ReverTra Ace^®qPCR RT试剂盒(Code No.FSQ-101)采用了本公司高性能逆转录酶『ReverTra Ace^®』，反应效率非常出色。另外，通过改良，使得带入到Realtime PCR反应体系中的逆转录反应液的影响降到最小，即使在PCR反应体系中添加20％体积的逆转录反应液，也能表现出良好的扩增线性。因此，最适合用于表达量较少的mRNA的高灵敏度检测。由于精简了试剂盒的构成，可非常简便地进行操作。 

特征

●可得到更广的可定量扩增区域

将Oligo dT 与Random Primer按最适比例预混，可均一、高效地在RNA全序列范围内进行逆转录，因此可得到更广的可定量扩增区域。

●与RealtimePCR试剂的配合性良好

采用了对RealtimePCR反应体系影响最小的组分，即使在PCR中添加最多20%的逆转录反应液，也可以得到很高的直线相关性。最适用于表达量少的mRNA的高灵敏度检测。

●完全预混型试剂(仅FSQ-201)

本品为放置于-20℃也不会冻结的完全预混型试剂。只要添加模板RNA和水，就可以简便高效率地合成cDNA，且重复性良好。

●容易配制逆转录反应的阴性对照(仅FSQ-201)

因为添附有相同的预混型no-RT对照，能够方便地配制逆转录反应的阴性对照。

实验例

1.模板RNA量的添加量对合成效率影响的探讨

在ReverTra Ace^® qPCR RT Kit的反应体系(10μl)中，分别添加HeLa细胞来源的total RNA 0.5μg - 0.5pg，分别进行逆转录反应。然后，采用和实验例2同样的方法进行cDNA合成量的比较。结果可见，在探讨的范围内，模板RNA的量和cDNA的得率密切相关，但无论模板RNA量的多寡，仍可维持很高的cDNA合成效率。由此可见，在目的片段浓度有差异的样品之间，逆转录反应效率的变化并不大，因此可将定量结果的误差控制在最小范围内。

2.与用其他公司产品cDNA合成量的比较

的cDNA量进行定量。结果可见，在使用本试剂盒的情况下，两个目的片段都有最高的得率。

3. RNase H 处理与否对检测灵敏度影响的比较以来源于HeLa细胞的total RNA 100ng为模板，使用ReverTra Ace^® qPCR RT Kit（蓝线）及另外添附RNase H的B公司cDNA合成试剂盒，按各自推荐的实验步骤进行逆转录反应(B公司试剂盒分别按RNase H处理（红线）/未处理（橙线）两种方法进行)。然后，按和实验例1同样的方法检测β-Actin的扩增效果。结果显示，用B公司的试剂盒RNase H未处理（橙线）的情况下，检测效果大幅下降。而用ReverTra Ace^® qPCR RT Kit（蓝线）进行反应，即便不追加RNase H处理也能显示出很高的扩增效率。已经过实验证明，用本试剂盒RNase H处理与否灵敏度相等。
※本试剂盒不包含RNase H处理步骤。

4.与其他公司预混型cDNA合成试剂的逆转录效率（cDNA合成量）的比

以HeLa total RNA 100ng为模板，按各公司试剂盒推荐条件进行逆转录，然后进行Realtime PCR对5种目的基因进行定量。结果显示，使用本试剂盒的cDNA得率更高。 

产品内容

[FSQ-101]

5x RT Buffer 400μl

Enzyme Mix 100μl

Primer Mix 100μl

Nuclease-free Water 1000μl×2支

[FSQ-201]

5x RT Master Mix 400μl×1支

5x RT Master Mix no-RT Control 40μl×1支

Nuclease-free Water 1,000μl×2支

※各试剂盒均为10μl反应体系情况下，可以使用200次。

注意事项

本试剂盒中附带的5x RT Master Mix 及 5x RT Master Mix no-RT Control不能用在本公司的姊妹产品 ReverTra Ace^® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover (Code No. FSQ-301)中〔组分不同〕。
请务必注意。

基本反应条件

[FSQ-101]
将RNA置于65℃，5min.
↓
置于冰上

灭菌蒸馏水 X μl
5x RT Buffer 2 μl
Enzyme Mix 0.5 μl
Primer Mix 0.5 μl
RNA 0.5pg～1μg
Total Volume 10 μl
↓
37℃, 15min.
98℃, 5min.

[FSQ-201]
将RNA置于65℃，5min.
↓
置于冰上

Nuclease-free Water　 Xμl
5x RT Master Mix 　　　2μl
RNA template 　1pg～1μg
Total volume 　　　　　10μl
↓
37℃, 10min.
50℃, 　5min.
98℃, 　5min.
4℃, 　　hold.