用途

PCR

说明

KOD FX Neo是在高成功率PCR酶KOD FX的基础上添加了「延伸增强剂」而开发的PCR酶。在保持高扩增效率的同时，进一步提高了对难扩增序列、微量模板DNA、长目的片段及粗样品的扩增效率。

特征

●特征1.　延伸性UP

・以基因组DNA为模板最大可扩增40kb的片段
・实现了30 sec/kb的高速循环（粗样品推荐1min/kb）
・最适用于高GC含量目的片段的扩增
此外，还适用于使用抗体的热启动法，可进行特异性良好的扩增。

●特征2.　对粗样品的扩增性能UP
・提高了对植物裂解液、小鼠尾巴的扩增效率
・降低了土壤成分、食品成分等的PCR抑制效果
・与基础版产品KOD FX一样，可对革兰氏阳性菌、酵母、霉菌等直接进行PCR

原理

KOD DNA Polymerase具有卓越的延伸性，同时对粗样品成分中的抑制物质有很强的抵抗力。
KOD FX就是利用这种特性而开发出来的高成功率PCR酶，该酶在难扩增序列及粗样品的扩增方面受到了广泛的好评。
然而，以KOD FX为代表的以往的PCR酶在20~30个循环以后，很容易出现扩增无法持续的<停滞现象>，PCR的功能无法完全发挥出来。

【KOD FX Neo】是在KOD FX的基础上，应用了本公司新开发的【延伸增强剂】技术，从而成功地抑制了<停滞现象>，进一步提高了对长目的片段、难扩增序列及粗样品等的扩增效率。

实验例

1. 扩增长度的比较

使用KOD FX Neo及以往的产品，以人基因组DNA为模板进行长链目的片段的扩增。结果显示，只有使用KOD FX Neo的情况下，才可以确认扩增40kb长的目的片段。另外，与以往产品相比，KOD FX Neo只需一半的延伸时间(30sec/kb) *。因此，可以极大地缩短反应时间。

*粗样品扩增时建议按1min/kb进行。

2. 检测灵敏度的比较

以人基因组DNA为模板进行检测灵敏度的比较。结果可见，与原产品相比，KOD FX Neo的灵敏度提高了约10倍。

3. 扩增的比较

以碱裂解法制备的鼠尾裂解液为样品，扩增3种小鼠的基因。结果可见，只有用KOD FX Neo才能得到良好的扩增。像这样，KOD FX Neo能够对样品进行直接PCR，可以省略掉繁杂的纯化过程。

使用96孔PCR板的鼠尾处理方法(碱裂解法)

将鼠尾(约3 mm)放入离心管中。
↓←添加50 mM NaOH 180μl，盖上盖子，用Vortex充分振荡
↓spin down（轻轻地振荡使液体落到管下部)
↓95℃, 10 min.孵育(使用Thermo cycler)
↓←添加1 M Tris-HCl (pH 8.0) 20μl，盖上盖子，用Vortex充分振荡
↓spin down（轻轻地振荡使液体落到管下部)
取0.5〜2μl上清(模板)添加到50μl反应体系中进行PCR反应

※鼠尾切片，请切得小一些，使之能够浸没在裂解液中。
※请注意热碱。
※处理后，鼠尾不会完全溶解。大约只能溶解鼠尾的表面。
※本方法，可使用1.5m的离心管。

4.腐殖酸添加实验

腐殖酸(humic acid)是存在于腐殖土及土壤中的红褐色或黑褐色有机物质，对PCR有抑制作用。
通常进行的DNA纯化过程中不能去除这种腐殖酸，因此，以环境、生态体系中的样品作为模板进行PCR非常困难。
这里，以人基因组DNA中混入腐殖酸为例，探讨了其对PCR的抑制作用。结果显示，KOD FX Neo对抗腐殖酸的能力最强。
因此，使用KOD FX Neo可以对环境、生态体系中的样品进行PCR。

产品内容

[KFX-201]

KOD FX Neo (1U/μl)200μl×1支
2×Buffer for KOD FX Neo* [KFX-2B]
1.7ml×3支
2mM dNTP**[NTP-201]1ml×2支

*含有终浓度2.0mM的Mg²⁺。

** 使用本酶进行PCR时，请使用dNTPs[NTP-201]。如果使用其他的dNTPs，有时可能得不到良好的扩增性能。

※50μl反应体系的情况下可使用200次。

活性的定义:

在75℃活性测定条件下，在30分钟内摄入10nmoles的全核苷酸使成为酸不溶物时所需酶的活性定义为1U。

来源:

E.coli 重组体

基本反应条件

灭菌蒸馏水X μl
2×PCR buffer for KOD FX Neo25μl
2mM dNTPs10μl
10pmol /μl Primer F1.5μl
10pmol/μl Primer R1.5μl
KOD FX Neo(1.0U/μl)1μl
Genomic DNA10～200ng
Plasmid DNA1～50ng
cDNA ～200ng(RNA相当)
粗样品 ～2μl
〈一步法植物裂解液1μl〉

Total Volume50μl

〈2步法循环〉*
94℃, 2min.
↓
98℃, 10sec.
68℃, 30sec./kb 25～45 cycles

〈3步法循环〉*
94℃, 2min.
↓
98℃, 10sec.
Tm℃, 30sec.
68℃, 30sec./kb 25～45 cycles

〈Step down循环〉*
94℃,2min.
↓
98℃,10sec.
74℃,30sec./kb 5 cycles
↓
98℃,10sec.
72℃,30sec./kb 5 cycles
↓
98℃,10sec.
70℃,30sec./kb 5 cycles
↓
98℃,10sec.
68℃,30sec./kb 15～30 cycles
↓
68℃,7min.

*基本上以2步法循环进行。引物的Tm值低于68℃或用2步法循环未见扩增时，请试一下3步法循环。另外，扩增10kb以上的目的片段时，如果出现Long PCR片段或非特异条带及弥散，请试一下Step down循环。

※Tm值采用最邻近法(Nearest Neighbor method)计算得到的值。引物的Tm值以及扩增产物的Tm值计算请点击此处进入在线工具

<碱裂解法>

1) 将鼠尾(约3mm)放入离心管中。

2) 添加50mM NaOH 180μl。

3) Vortex充分振荡。

4) 95℃・10min.

5) 添加Tris-HC(l pH8.0) 20μl。

6) Vortex充分振荡。

7) 离心(12,000rpm, 10min.)

8) 取0.5～2μl上清进行PCR反应。

(鼠尾不会也无需完全溶解)

<一步法>

1) 将叶片(3mm)或精米(1粒) 放入离心管中。

2) 添加Buffer A* 100μl。

3) Vortex充分振荡。

4) 95℃・10min.

5) Vortex充分振荡。

6) 离心(12,000rpm, 10min.)

7) 取1μl上清进行PCR反应。

(植物组织不会也无需完全溶解)

*Buffer A:

 100mM Tris-HC(l pH9.5)

 1M KCl

 10mM EDTA