用途

Illumina公司二代测序用文库定量

说明

GenNext^TMNGS Library Quantification Kit是illumina^®二代测序用的文库定量试剂盒。

Illumina公司NGS测序仪上加载的文库量对数据的数量及质量有很大影响。文库量过少，簇密度就较低，得到的测序数据量就比较少。相反，文库量过多，簇清晰度就变差，数据质量就会下降。因此，文库的正确定量就变得非常重要。

文库定量的方法有分光光度检测法及荧光测定法，这些测定法中，因为测定的是全部的DNA，所以不能正确地测定对测序有效的包含P5、P7接头的DNA的浓度。
GenNext^TMNGS Library Quantification Kit中，设计了能与Illumina公司采用的P5、P7序列配对的引物，来进行qPCR法分析，能准确地定量能够结合在Flow cell的文库。另外，因为使用了KOD SYBR^®qPCR Mix，针对长链及GC富集的目的片段，也可以稳定进行文库定量。

我们提供了文库浓度计算工具，方便进行定量后的分析。请点击此处进入在线工具或下载计算软件本地操作。

特征

●低偏差的正确定量

使用了KOD SYBR^®qPCR Mix，不易受文库GC含量及长度影响，无论何种文库都可以正确地定量。使用本试剂盒定量得到的值，可以得到稳定的簇密度。

●可以较广的范围内进行定量

备有从20pM至0.0002pM的6个浓度的Standard DNA，能够在较广的范围内正确地定量。

●简便

本试剂盒含有文库定量必需的全部试剂（qPCR试剂、Primer Mix、Standard DNA及文库稀释用buffer），可以简单地进行文库定量。

实验例

1. 不同目的片段长度时PCR效率的比较

用各公司的文库定量试剂盒对附加有接头序列的150~800bp的模板DNA进行分析，比较了PCR效率。结果显示，其他公司的文库定量试剂盒随着目的片段长度的变长，可以看到PCR效率降低，本试剂盒没有因目的片段长度变化而出现PCR效率下降。

2.各种GC含量的目的片段的PCR效率比较

用各个公司的文库定量试剂盒对附加有接头序列的各种GC含量的模板DNA进行分析 ，比较PCR效率。结果显示：其他公司的文库定量试剂盒在定量GC含量高的目的片段时，如融解曲线分析图所示，不能确认目的片段的扩增，PCR效率也不能测定。另一方面，使用本试剂盒可特异地扩增全部的目的片段，而且各目的片段的PCR效率误差也最小。

通常，含有CpG的启动子区域或嗜热菌等细菌中GC含量比较高。在对其进行文库定量时，使用不易受GC影响的本产品就可以正确地进行定量。

3.使用易于形成二级结构的短链目的片段进行探讨

将附加有接头序列的miRNA(human let-7a)序列(144bp)和Standard DNA为模板进行分析得到的扩增曲线进行比较。将miRNA目的片段稀释至20pM之后，按10倍的梯度进行稀释，与试剂盒中添加的Standard DNA同时进行分析。

结果显示，miRNA目的片段与Standard DNA的扩增曲线与各稀释水平基本一致，PCR效率分别是97.8%（miRNA）和97.1%（Standard DNA），也基本相等。通过本次探讨可以确认：像miRNA这样的易于形成二级结构的短链目的片段，使用本试剂盒，也能够准确地进行定量。

产品内容

・KOD SYBR^®qPCR Mix^*
KOD SYBR^®qPCR Mix
50x ROX reference dye

・Standard & Primer Set
Standard DNA 1～6^**
5× Primer Mix
50× Dilution Buffer

*含有1个套装的KOD SYBR^®qPCR Mix (Code:QKD-201)。
**含有20 pM, 2 pM, 0.2 pM, 0.02 pM, 0.002 pM, 0.0002 pM 浓度的Standard DNA 。
※20 μl 反应体系500次份。