用途

Realtime PCR 用cDNA的合成

说明

SuperPrep^®II Cell Lysis & RT Kit for qPCR[Code No. SCQ-401]是通过荧光定量PCR进行基因表达分析用的、由细胞裂解试剂(Lysis Reagents)和逆转录反应试剂(RT Reagents)组成的试剂盒。使用本产品，可以从用96孔板等培养的细胞开始，简便地制备含有能用作逆转录模板的RNA的细胞裂解物。而且，本试剂盒中含有的逆转录反应试剂，针对于从该细胞裂解物开始的逆转录反应进行了优化。

以前的SCQ-101，在Lysis Solution处理后，必需要添加Stop Solution。SuperPrep^®II 中，Lysis Solution处理后，可直接进行cDNA合成步骤。另外，可以使用更多种哺乳类细胞进行高灵敏度地检测。使用本试剂盒，可以简便、迅速地从培养细胞开始合成荧光定量PCR用的模板cDNA。

SuperPrep^®ⅡCell Lysis Kit for qPCR [Code No. SCQ-501]是单独销售的细胞裂解试剂（Lysis Reagents）。可以使用本公司的RNA-direct™ Realtime PCR Master Mix (Code No. QRT-101, QRT-201) ,THUNDERBIRD^®Probe One-step qRT-PCR Kit (Code No. QRZ-101)等1-step法RealtimePCR试剂进行分析（简易测定）。

特征

●无需纯化RNA
可简便地从培养细胞开始制备能用作逆转录反应模板的含有RNA的细胞裂解液。以Lysis Solution 处理的裂解液为模板，可直接进行逆转录反应，所以可大幅度缩短分析时间。

●从裂解液合成高品质的cDNA

通过优化的buffer组成，有效地抑制了因RNase等的细胞成分引起的RNA的降解（制备的裂解物中的RNA可在冰上稳定保持6小时）。另外，因为用gDNA Remover (DNase I)处理后再进行cDNA的合成，所以可以合成基因组DNA污染少的高质量的cDNA。逆转录试剂是用本公司的高效率逆转录酶「ReverTra Ace^®」进一步优化后的Master Mix，可简便、高效率地合成cDNA。合成的cDNA可长期保存。

※Master Mix中Random 引物和Oligo dT引物按最适比例进行了混合。

●可用于多种类型的哺乳类细胞
SuperPrep^®II 在提高了细胞裂解性能的同时，也降低了RNase的影响。与以前的SCQ-101相比，可使用更多种类的细胞进行分析。已确认下表中的代表性细胞可适用于本品。

          细胞名称     贴壁／悬浮           种类                       细胞                                                       来源

●降低了高通量分析时的误差

按照本操作步骤，移液分管及稀释操作步骤减少，降低了高通量分析时的误差。另外，细胞裂解时无需用移液枪头上下吹打混匀，而且同时可进行gDNA Remover处理，提高了操作性。无需添加反应终止液及引起RNA不稳定的加热操作。

●可以与各种荧光定量PCR试剂组合使用

可以与各种各样的荧光定量PCR试剂（SYBR^®Green I, TaqMan^®assay两种都可以）组合使用。

另外，与本公司的THUNDERBIRD^®Probe qPCR Mix(Code No. QPS-101 、KOD SYBR^®qPCR Mix (Code No. QKD-201)等组合使用，已确认可以从培养细胞开始简便且高度准确的进行基因表达分析。而且，与本公司的RNA-direct™Realtime PCR Master Mix (Code: QRT-101, QRT-201)等的1-step荧光定量PCR试剂组合使用，可进行简易的分析。

实验例

1. 纯化RNA与细胞裂解液的Ct值相关性的检验

使用SuperPrep^®II Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code No. SCQ-401)，从2.5x10⁴个H UVEC (人脐带静脉内皮细胞)细胞开始合成cDNA(40μl 反应体系)。另外，从HUVEC 细胞抽提的Total RNA66.6ng 开始，使用ReverTra Ace^® qPCR RT Master Mix (Code No. FSQ-201) 进行cDNA的合成(40μl 反应体系)。分别以各自的cDNA 为模板，使用THUNDERBIRD^®SYBR^®qPCR Mix (Code No. QPS-201)对15种House Keeping Gene进行荧光定量PCR。
结果显示，这次分析的15种基因，纯化RNA与使用细胞裂解物分析得到的结果具有良好的相关性。

2.细胞裂解液在冰上稳定性的确认

使用SuperPrep^®II Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code No. SCQ-401)，将4x10⁴个HeLa S3 细胞制备成细胞裂解液，转移到冰上，0 ～ 6小时后，取样细胞裂解液，立即进行cDNA 的合成。同样方法，本公司原来的产品(SuperPrep^®) 及A公司的试剂制备细胞裂解液，同样时间点取样，进行cDNA合成。以该cDNA为模板，使用THUNDERBIRD^®Probe qPCR Mix (Code No. QPS-101)进行荧光定量PCR对GAPDH基因的表达进行分析。
结果显示，可以确认HeLa S3 细胞在冰上放置6 小时，Ct值也不会有显著延迟。

3.悬浮细胞的96孔板分析及基因表达分析的实验例

【SCQ-401】
(Lysis Reagents)
Lysis Solution                 6.5ml×1支
gDNA Remover                 33μl×1支
RNase Inhibitor               110μl×1支

(RT Reagents)
5×RT Master Mix             860μl×1支
5×RT Mastre Mix no-RT control 
                                       86μl×1支
Nuclease free Water      1,700μl×2支

【SCQ-501】
Lysis Solution                  6.5ml×1支
gDNA Remover 　　　　 　33μl×1支
RNase Inhibitor 　　　　   110μl×1支

基本反应条件

<Lysate的制备>
按以下比例(1个反应)向Lysis Solution中添加
RNase Inhibitor 和 gDNA Remover
  Lysis Solution     58.7μl
  RNase Inhibotor       1μl
  gDNA Remover       0.3μl
               ↓
向含有细胞的各孔中添加Lysis Solution 
(含有RNase Inhibitor 及 gDNA Remover)
 60μl
               ↓
振荡30sec.后，室温温育4min.30sec.
               ↓
冰上

<逆转录(RT)反应>
按以以比例(1个反应)在冰上制备RT Master Mix
  5x RT Master Mix     8μl
  Nuclease-free Water 24μl
               ↓
每孔32μl分装
               ↓
添加裂解液8μl
               ↓
37℃,15min.
50℃, 5min.
98℃, 5min.