用途

Realtime PCR

说明

THUNDERBIRD qPCR Mix是在Taq DNA polymerase基础上开发的高效率Realtime PCR用Master Mix（2×浓度）, 是Realtime PCR Master Mix系列的改良产品。 最适合用于以cDNA、病毒DNA为样品的Realtime PCR分析。本系列产品有TaqMan^® Assay（Probe Assay）用及SYBR^®Green I用两类试剂盒可供选择。本产品通过采用新的增强剂等手段，对组分进行了根本性的改良，使得反应特异性和PCR效率有了飞跃式的提升，从而可得到更广的可定量扩增区域（dynamic range），而且可适用于模块型及毛细管型等各类仪器。 

特征

●均一地检测各种目的片段
采用了新的增强剂，对各种目的片段PCR效率的波动可控制在最小范围内。

●可以在较广的范围内进行检测

通过特异且高效率的扩增，可以在较广的测定范围内进行分析。

●高特异性(降低了引物二聚体)

通过对组分的最优化，使得PCR的特异性更高。通过降低非特异性反应，使得SYBR^® Green I及TaqMan^® Assay等对低拷贝目的片段的检测灵敏度更高。
(请参考实验例)

●使用了高纯度Taq DNA polymerase

PCR的基本性能得到了改善。

●适用于各类仪器

除适用于普通及高速的模块型(Block Type)仪器外，还适用于使用玻璃毛细管(Glass Capillary Type)的高速循环仪。由于另外添附了50× ROX reference dye，对于使用Passive Reference的仪器(如Applied Biosystems公司制造的仪器、Stratagene公司制造的仪器)，可根据各种仪器的特征把ROX调整到最适浓度。

●高速hot start

本产品采用了抗Taq聚合酶抗体的热启动系统。由于通过升温能使抗体迅速失活，因此预变性时间可以设定为很短。

实验例

SYBR^®Green I检测体系的反应特异性比较

使用β-Actin cDNA的引物对，比较了各Realtime PCR试剂的反应特异性。

引物对是能扩增人的β-Actin cDNA的引物，模板是使用本公司高性能的逆转录试剂「ReverTra Ace^®qPCR RT Kit [Code No. FSQ-101]」合成的HeLa细胞Total RNA来源的cDNA，将cDNA作10倍的梯度稀释(4个梯度)，以no-template control(NTC)一起，分别作了复孔进行实验。(使用Roche Diagnostics LightCycler^®1.1)

产品内容

【QPS-101T,QPS-201T】
qPCR Mix1ml ×1支
50X ROX reference dye50μl
(50μl反应体系40次，或20μl体系100次)

【QPS-101,QPS-201】
qPCR Mix1.67ml ×3支
50X ROX reference dye250μl
(50μl反应体系200次，或20μl体系500次)

基本反应条件

〈SYBR^® Green I 法〉
灭菌水Xμl
qPCR Mix10μl
Forward Primer6pmoles
Reverse Primer6pmoles
DNA样品Yμl
50×ROX referencre dye0.4/0.04μl^*

Total Volume20μl

*50×ROX reference dye，是对于使用 Passive Reference 的仪器（如Applied Biosystems 公司制造的仪器等），为校正各孔间的荧光强度及分注误差而使用。不用 Passive Reference 进行校正的仪器无需添加。

Cycle
〈2步法〉
95℃     20～60sec.
         ↓
95℃     1～15sec
60℃     30～60sec.
40 cycles

〈3步法〉
95℃     20～60sec.
        ↓
95℃     1～15sec
55～65℃  5～30sec.
72℃     30～60sec.

40 cycles

※退火温度，请在引物的Tm~Tm-5℃的范围内设定。
※目的片段在 300bp 以下时，延伸时间 30 秒即可进行充分的反应。但一部分仪器为了能够测定到稳定的荧光，延伸时间需大于 30 秒。扩增曲线散乱，或各孔间的差异较大时，请设定较长的延伸时间（45-60 秒）。